亚麻籽油的安全性与功能性评价(4)

[10]Vargas-Ramella M，Munekata P E S，Pateiro M，et al. Physicochemical Composition and Nutritional Properties of Deer Burger Enhanced with Healthier Oils[J].Foods，2020，9（5）：571.

[11]Yuki U，Yoshiyuki K，Yamato N，et Perilla and Linseed Oils Induce Neuronal Apoptosis by Caspase-Dependent and -Independent Pathways[J].Foods (Basel, Switzerland)，2020，9（5）：538.

[12]廖丽萍，肖爱平，冷鹃，等.不同产地亚麻籽冷榨油脂肪酸的GC-MS 分析[J].中国麻业科学，2018，40（5）：234-238．

[13]韩飞，马广强，熊魏，等.牛至油增强小鼠免疫功能的实验研究[J].中国医院药学杂志，2020（10）：1106-1110.

[14]张勇.紫丁香甙的测定及其降血脂、增强免疫力的研究[D].长春：吉林大学，2004.

[15]Suri Kanchan， Singh Balwinder， Kaur Amritpal， ect. Influence of microwave roasting on chemical composition， oxidative stability and fatty acid composition of flaxseed（Linum usitatissimum L.) oil.[J]. Foods Chemistry，2020，326：.

亚麻是一种高油料作物，又称胡麻，主要用于植物油脂——亚麻籽油的提取[1]。亚麻籽油中含丰富的营养成分，如维生素E、甾醇等，还含有特有的亚麻木酚素与亚麻肽[2-3]。另外，亚麻籽油的脂肪酸中不饱和脂肪酸含量较高，其中α-亚麻酸含量高达40%以上，是目前最理想的单一植物油脂[4-5]。因其特有的营养成分及比例，研究表明在治疗心血管疾病、糖尿病等多种疾病方面具有显著的疗效[6-7]，亚麻籽油被誉为植物界的“深海鱼油”，市场开发前景巨大[8-9]。因此，广大的学者针对亚麻籽油的制备工艺、参数优化、营养成分进行深入的研究[10-11]。亚麻籽油因其独特的营养品质，针对其提取及加工已取得了一定的成果[12]，其相关产品的开发应用前景必然广阔。因此，本文以大鼠为研究对象，进行为期4周的实验，主要考察亚麻籽油对大鼠体重、进食量、食物利用率、脏体比的影响，并进一步分析高剂量实验组的大鼠胃、肠、脾、肝脏等组织病理学的变化，分析亚麻籽油对大鼠身体功能的影响，为其全面利用和开发亚麻籽油提供科学指导和理论依据，为开发功能保健食品提供借鉴。1 材料与方法1.1 材料与试剂亚麻籽油（亚麻酸含量40%），由山西五台山沙棘制品有限公司提供，为浅黄色至黄色液体。体重65 ～79 g 清洁级SD 大鼠80 只，雌雄各半，由上海莱斯克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2012-0008。体重18 ～22 g 清洁级ICR雌性小鼠200 只，由上海莱斯克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。饲料，由上海普路腾生物科技有限公司提供，许可证号：沪饲证（2014）04001。注射用墨汁，刀豆蛋白A（ConA），MTT，DNFB，丙酮，麻油，SRBC，生理盐水，鸡红细胞，羊红细胞，甲醇，Giemsa 染色，YAC-1 细胞，Hanks液（pH 7.2 ～7.4），RPM 完全培养液，乳酸锂，碘硝基氯化四氮唑（INT），吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、NAD、Tris-HCl 缓冲液（pH8.2），1%NP40，台酚兰，1mol/L 盐酸，酸性异丙醇等 仪器设备SHANDON EXCELSIOR 全自动密封脱水机，电热鼓风干燥箱，OlympusIX71 倒置显微镜，8 mm 直径打孔器，微量血凝试验板，2-16K 通用离心机，RT-6100 酶标仪，96 孔培养板，Co-150 CO2培养箱，UV-1800 紫外可见分光光度计，OlympusIX71 倒置显微镜，电子天平，显微?实验方法1.3.1 受试样品及配制亚麻籽油的成人日推荐量为3 g，即0.05 g·kg-1BW（成人体重以60 kg 计）。功能性评价实验组按日推荐量的5 倍、10 倍、30 倍配制受试样品浓度，分别为0.150、0.050、0.025 g·mL-1的高、中、低3个剂量组，以食用大豆油作为对照组。临用前，称取亚麻籽油15 g 与食用大豆油混合均匀至100 mL，为高剂量组；取高剂量组样品40 mL，与食用大豆油混合均匀至120 mL，为中剂量组；取中剂量组样品40 mL，与食用大豆油混合均匀至80 mL，作为低剂量组；安全性评价实验组按照亚麻籽油受试物成人日推荐量的25、50 和100 倍，设3个剂量组为1.25、2.50、5.00 g·kg-1BW，受试样品采用同功能性评价小组相同的配制方法 动物分组与给药（1）安全性评价实验组。参照韩飞等[13]的方法，各性别动物按体重随机分成4 组、每组10 只。试验按照亚麻籽油受试物成人日推荐量的25、50 和100 倍，设3个剂量组为1.25、2.50、5.00 g·kg-1BW，另设食用大豆油为空白对照。试验期间单笼喂养，自由进食饮水，每天定点灌胃（10 ∶00），观察动物形态，分别进行试验。（2）功能性评价实验组。200只小鼠随机分成5大组，再分成4 小组，每小组10 只小鼠，按0.150、0.050、0.025 g·mL-1的高、中、低剂量组每天定点灌胃（10 ∶00），连续灌胃30 d 后，分别进行试验 安全性评价实验组实验方法对选取的安全性实验组的大鼠连续灌胃30 d，进行食物利用率、病理组织学检查。食物利用率公式为：1.3.4 功能性评价实验组实验方法（1）小鼠体重的测定。标记每只小鼠，对小鼠定点测定体重，记录小鼠的初始体重和终期体重。（2）免疫器官系数。参照张勇[14]的实验方法。小鼠适应性喂养3 d，随机分成对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组10 只。按每日10 mL·kg-1BW 连续灌胃，连续30 d，末次给药5 h 后，脱颈椎处死小鼠，称量小鼠体重，取腹腔液后，无菌分离肝脏和脾脏，称重。（3）碳廓清实验。末次给药5 h 后，注射印度墨水并记时，2、10 min，分别取内眦静脉丛血20 μL，并立即加入2 mL 0.1%NaCO3溶液中，以NaCO3溶液为空白对照，在600 nm 处测定OD 值，将小鼠处死后，取出肝脏、脾脏后称重，计算吞噬指数a。式（3）中：K-碳廓清指数，表示吞噬速率；OD1-t1时的吸光度值；OD2-t2时的吸光度值；t1-给墨汁后第2 次取血的时间；t2-给墨汁后第2 次取血的时间；a-吞噬指数，反映每单位组织质量的吞噬活性。（4）血清溶血素的测定。将小鼠摘除眼球采血，2000 r·min-1离心10 min 进行血清的分离，用生理盐水稀释不同倍数并置于微量血凝板内，每孔100 μL，加入同体积的0.5%（v/v）的SRBC 悬液，混匀，37 ℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度[15]。按公式（5）计算抗体积数。式中1、2、3......n 代表对倍稀释的指数，S 代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。0 级红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。（5）迟发型变态反应（DTH）检测。末次给药5 h 后，对小鼠腹部皮肤约3 cm×3 cm 进行脱毛处理，用50 μL 的DNFB 溶液涂抹均匀致敏；5 d 后，再以10 μL 的上述溶液均匀涂抹小鼠右耳。24 h 后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳，用打孔器取下直径8 mm的耳片称重，按公式（6）计算左右耳肿胀度差。左右耳肿胀度差=右耳重量-左耳重量 （6）1.4 数据处理所有试验的平行试验次数至少3 次。实验数据以SPSS 软件进行单因素方差分析。经方差齐性检验，方差齐的实验数据采用LSD 法进行统计分析，方差不齐的实验数据采用Tamnane 法进行统计分析。当概率值≤0.05 时，判定为统计学显著。2 结果与分析2.1 亚麻籽油的安全性分析2.1.1 对大鼠食物利用率的影响亚麻籽油对大鼠食物利用率的影响见表1。由表1 可知，随着时间的增加，对照组与各剂量组大鼠的食物利用率呈降低趋势，与雌性大鼠比较，雄性大鼠的食物利用率普遍较高。其中，雄性大鼠的食物总利用率在34%左右，而雌性大鼠的食物总利用率在24%左右，与同性别同时期的对照组比较，大鼠的食物利用率无显著差异。说明受试样品亚麻籽油对大鼠的食物利用率无影响。表1 亚麻籽油对大鼠食物利用率的影响表性别 组别 动物数/只第一周利用率/%第二周利用率/%第三周利用率/%第四周利用率/%总利用率/%雄对照组 10 47. 41. 32. 24. 34.低剂量组 10 47. 39. 34. 24. 34.中剂量组 10 47. 40. 32. 23. 34.高剂量组 10 45. 43. 32. 24. 34.雌对照组 10 42. 30. 20. 12. 24.低剂量组 10 43. 29. 21. 13. 24.中剂量组 10 42. 32. 19. 12. 23.高剂量组 10 43. 31. 18. 13. 24. 亚麻籽油对大鼠病理组织学的影响各剂量组大鼠检查未发现明显病变，且生化指标未见异常，因此仅选对照组及高剂量作组织病理学检查。大鼠胃、肠、脾、卵巢和睾丸病理检测结果见表2，大鼠肝脏与肾脏病理检测结果见表3。由表2、表3 可知，正常肝小叶结构存在，肝细胞无明显肿胀及颗粒变性，个别肝细胞浆内出现少许细小的脂肪空泡，呈轻度脂肪变，脂变干细胞呈散在小灶分布，范围小。干细胞无坏死改变，少数肝小叶、肝汇管区见淋巴细胞等炎细胞浸润，无纤维组织增生，胆管未见异常；胃和十二指肠黏膜完整，无明显出血、坏死、糜烂、溃疡及炎细胞浸润，无明显腺体增生萎缩改变；肾皮髓质结构清楚，肾小管无明显肿胀及空泡变性，个别肾间质中有灶性炎细胞浸润，个别肾髓质部可见小囊肿；脾白髓、红髓结构清楚，白髓、红髓无明显扩张或萎缩现象；睾丸曲细精管正常，可见各级生精细胞及成熟精子；卵巢发育正常，可见各级卵泡和成熟黄体。综合可知，以上病理学改变仅个别动物中发生，各组标本病理变化无明显差异，因此，亚麻籽油对各脏器未产生病理学改变。表2 大鼠病理检测的结果表注：对照组、高剂量组大鼠雌雄各10 只，下同。病理指标 对照组 高剂量组 病理指标 对照组 高剂量组雄 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌黏膜出血/例 0 0 0 0 色素沉着/例 0 0 0 0水肿/例 0 0 0 0 囊肿/例 0 0 0 0炎细胞浸润/例 0 0 0 0 生精上皮细胞减少/例 0 0 0 0坏死/例 0 0 0 0 生精上皮细胞变性/例 0 0 0 0萎缩/例 0 0 0 0 生精上皮细胞坏死/例 0 0 0 0增生/例 0 0 0 0 多核巨细胞浸润/例 0 0 0 0红髓扩张/例 0 0 0 0 间质出血/例 0 0 0 0白髓萎缩/例 0 0 0 0 间质水肿/例 0 0 0 0造血细胞增生/例 0 0 0 0 其他/例 0 0 0 0表3 大鼠肝脏与肾脏病理检测结果表（例）病理指标 对照组 高剂量组 病理指标 对照组 高剂量组雄 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌肝小叶 被膜改变 0 0 0 0 皮质部 肾小管坏死 0 0 0 0坏死 0 0 0 0 肾小管肿胀 0 0 0 0出血 0 0 0 0 肾小管空泡变 0 0 0 0空泡变 1 1 1 1 肾小管管型 0 0 0 0颗粒变性 0 0 0 0 肾小管炎症细胞浸润 0 0 0 0肝细胞索断裂 0 0 0 0 肾小球变性 0 0 0干细胞肿胀 0 0 0 0 间质内炎细胞浸润 1 0 0 0炎症细胞浸润 2 2 2 2 其他 0 0 0 0其他 0 0 0 0 髓质部 曲管上皮坏死 0 0 0 0汇管区 坏死 0 0 0 0 曲管上皮肿胀 0 0 0 0出血 0 0 0 0 曲管上皮空泡变 0 0 0 0胆管增生 0 0 0 0 曲管上皮管型 0 0 0 0炎症细胞浸润 2 2 2 2 曲管上皮炎症细胞浸润 0 0 0 0其他 0 0 0 0 间质细胞浸润 0 0 0 0被膜改变 0 0 0 0 小囊肿 0 1 0 0肾盂部乳头改变 0 0 0 0 移形上皮细胞改变 0 0 0 02.2 亚麻籽油的功能性分析2.2.1 对小鼠体重的影响亚麻籽油对小鼠体重的影响如图1 所示。由图1可知，30 d 灌胃试验结束后，低剂量组小鼠的体重最高为33.2 g，与对照组比较，高、中、低各剂量组小鼠的体重均无显著差异（P＞0.05），说明亚麻籽油对小鼠体重无影响 对小鼠各组脏器与体重比值的影响正常时各脏器与体重的比值比较恒定。当动物染毒后，受损脏器重量可能发生改变，从而引起脏体比的变化。各剂量组胸腺指数、脾指数的测定结果如图2 所示。由图2 可知，与对照组比较，高、中、低各剂量组均无显著差异（P＞0.05）。从统计学方法分析说明了亚麻籽油对小鼠的脏器/体重比值无影响，不能促进免疫器官的增长。小鼠经灌胃不同剂量的亚麻籽油30 d，小鼠免疫功能的变化见表4。免疫细胞包括参与免疫应答及免疫应答相关的细胞，如淋巴细胞、单核-巨噬细胞等。其中单核巨噬细胞具有多种免疫调节的功能，而吞噬指数是反映机体非特异性免疫功能的重要指标。由表4 可知，高、中、低剂量组的碳廓清功能显著高于对照组，且存在一定的剂量依赖关系。说明了不同剂量的亚麻籽油能够增强单核-巨噬细胞功能。抗体的功能是基于免疫球蛋白分子结构，与其他球蛋白分子区别在于能与抗原发生特异性结合和识别抗原的作用。由表4 可知，各剂量组显著高于对照组，随着受试样品浓度的增加，抗体生成量更多，从而引起溶血数量增加，说明了亚麻籽油促进小鼠的抗体生成数增加。迟发型变态反应（DTH）是由T 细胞介导的细胞免疫应达的一种类型，是一种常见的免疫反应，因此其反应的强度能反映细胞免疫水平，由表4 可知，高剂量组的左右耳肿胀度（即抗体水平）显著高于对照组，说明了亚麻籽油能够增强细胞免疫活性。图1 亚麻籽油对小鼠体重的影响图图2 胸腺指数、脾指数的测定图表4 亚麻籽油对小鼠免疫功能的影响表注：相同字母代表不存在显著性差异，P ＜0.05。组别 动物数/只 吞噬指数a 抗体积数 左右耳肿胀度差/mg对照组 10 4. 65. 20.低剂量组 10 4. 70. 21.中剂量组 10 4. 71. 21.高剂量组 10 4. 71. 23. 结论经30 d 灌胃实验后，与对照组比较，高、中、低各剂量组对大鼠的食物利用率与脏体比均无统计学意义（P＞0.05）。同时，亚麻籽油高剂量组对大鼠的胃、肠、脾、卵巢、睾丸、肝脏以及肾脏等均未产生病理学的改变，说明亚麻籽油对小鼠身体无不良影响，安全性较高；经功能性实验发现，亚麻籽油对小鼠的体重与免疫器官系数均无显著影响，但对小鼠的免疫能力如吞噬指数、抗体积数与左右耳肿胀度差等指标具有显著的提高作用，因此，根据《保健食品检验与评价技术规范》的规定，亚麻籽油可提高小鼠的免疫功能，为其在食品、保健食品的开发应用提供理论依据。参考文献：[1]吕俊丽，马雪慧，王华.微波预处理对亚麻籽油得率及其贮藏稳定性的影响[J].中国油脂，2020，45（6）：13-17.[2] Addis C C， Koh R S，Gordon M and Characterization of a Bio-based Polymeric Wood Adhesive Derived from Linseed Oil[J].Elsevier Ltd，2020,102：.[3]利嘉祥，连莹君，张参，等.乙醇萃取-HPLC 法快速分析亚麻籽油中四种环肽研究[J].粮食与食品工业，2016，23（2）：8-12，18.[4]Shingfield K J, Scollan V, Toivonen D E.Effect of linseed oil and fish oil alone or as an equal mixture on ruminal fatty acid metabolism in growing steers fed maize silagebased diets, Journal of Animal Science, 2011，89（11）：3728-3741.[5]Gou Z Y，Cui X Y，Li L. Effects of dietary incorporation of linseed oil with soybean isoflavone on fatty acid profiles and lipid metabolism-related gene expression in breast muscle of chickens[J]. Animai,2020.[6]Rahiminezhad Z，Gahruie H H，Esteghlal stability of linseed oil nano-emulsions filled in calcium alginate hydrogels[J].Elsevier Ltd，2020，127:.[7]Szyd?owska-Czerniak A，Tymczewska A，Momot M. Optimization of the microwave treatment of linseed for cold-pressing linseed oil - Changes in its chemical and sensory qualities[J].Elsevier Ltd，：.[8]Yuan Z，Zhang LX，Wang D，et al. Detection of flaxseed oil multiple adulteration by nearinfrared spectroscopy and nonlinear one class partial least squares discriminant analysis[J].Elsevier Ltd，2020，125：.[9]Sevda S G, Mohammad A, Hamed J V，et of flaxseed oil supplementation on the erythrocyte membrane fatty acid composition and endocannabinoid system modulation in patients with coronary artery disease：a doubleblind randomized controlled trial[J]. Genes &nutrition，2020，15（1）：9.[10]Vargas-Ramella M，Munekata P E S，Pateiro M，et al. Physicochemical Composition and Nutritional Properties of Deer Burger Enhanced with Healthier Oils[J].Foods，2020，9（5）：571.[11]Yuki U，Yoshiyuki K，Yamato N，et Perilla and Linseed Oils Induce Neuronal Apoptosis by Caspase-Dependent and -Independent Pathways[J].Foods (Basel, Switzerland)，2020，9（5）：538.[12]廖丽萍，肖爱平，冷鹃，等.不同产地亚麻籽冷榨油脂肪酸的GC-MS 分析[J].中国麻业科学，2018，40（5）：234-238．[13]韩飞，马广强，熊魏，等.牛至油增强小鼠免疫功能的实验研究[J].中国医院药学杂志，2020（10）：1106-1110.[14]张勇.紫丁香甙的测定及其降血脂、增强免疫力的研究[D].长春：吉林大学，2004.[15]Suri Kanchan， Singh Balwinder， Kaur Amritpal， ect. Influence of microwave roasting on chemical composition， oxidative stability and fatty acid composition of flaxseed（Linum usitatissimum L.) oil.[J]. Foods Chemistry，2020，326：.

文章来源：《立体定向和功能性神经外科杂志》 网址: http://www.ltdxhgnxsjwkzz.cn/qikandaodu/2021/0205/331.html